前言
年，复旦大医院创伤急危重症医学科唐建国教授课题组在FrontiersinCellularandInfectionMicrobiology期刊发表的题为“DiallylDisulfide(DADS)AmelioratesIntestinalCandidaalbicansInfectionbyModulatingtheGutmicrobiotaandMetabolitesandProvidingIntestinalProtectioninMice”的研究成果，通过粪便微生物16SrRNA测序和粪便LC-MS代谢组学研究方法，发现了DADS显著减轻了DSS诱导下肠道白色念珠菌感染，并改变了小鼠肠道微生物群落结构和代谢特征，探究了DADS可以调节肠道微生物群和代谢物并保护肠道屏障的内在机理，为治疗白色念珠菌感染提供了理论依据。
中文标题：二烯丙基二硫化物(DADS)通过调节肠道微生物群和代谢物来保护小鼠肠道及改善白色念珠菌感染
研究对象：小鼠粪便
发表期刊：FrontiersinCellularandInfectionMicrobiology
影响因子：5.
发表时间：年1月7日
合作单位：复旦大医院创伤急危重症医学科
运用生物技术：粪便代谢组分析（由鹿明生物提供技术支持）、微生物16SrRNA测序
研究背景
白色念珠菌是人类最常见的病原体，是人体肠道微生物群的正常组成部分。肠道屏障受损在肠道菌群失调和真菌病中也起着重要作用。因此，了解和预防与白色念珠菌感染相关的疾病具有重要意义。越来越多的研究表明，肠道微生物群、代谢物和肠道屏障可能影响白色念珠菌的侵袭。研究表明，炎症性肠病(IBD)与结肠内微生物和代谢环境的变化有关，参与信号转导和免疫系统调节、影响抗生素的活性，肠道细菌产生的一些代谢物可以调节肠上皮和免疫功能，然而很少有研究人员将肠道微生物群的研究与肠道白色念珠菌感染期间粪便代谢物变化的研究结合起来。
大蒜作为一种日常食用的食物，也是一种由来已久的常用中药。大蒜中的有效成分是二烯丙基二硫醚(DADS)，又称大蒜素，具有抗真菌、抗菌、抗肿瘤等作用，可改善心血管疾病，然而，涉及DADS治疗肠源性白色念珠菌感染的动物实验尚未见报道，治疗机制是否涉及肠道菌群，代谢物和肠道屏障尚未研究。本研究通过DSS诱导肠道破坏建立更能代表人体肠源性白念珠菌感染的动物模型，探索DADS治疗的机制。
研究思路
研究结果
在DSS小鼠模型中诱导肠道白色念珠菌感染
作者评估了DADS是否可以在肠道白色念珠菌感染性小鼠模型中发挥抗真菌和抗炎作用（图1）。在用3%DSS处理并用白色念珠菌重复灌胃后，粪便白色念珠菌水平维持在CFU/g粪便（图1A、B）。随后作者用三种浓度的DADS处理感染的小鼠：6、20和40mg/kg（图1C）进行了实验设计。
图1
动物实验设计示意图
a)动物模型中白色念珠菌感染的示意图
b)粪便中的真菌负担
c)比较不同浓度DADS作用的实验示意图。使用METABRIC数据集使用CTR1或SLC31A1表达的患者存活率
不同浓度DADS对白念珠菌感染小鼠的影响
通过评估存活率、结肠长度和疾病活动指数，确定20mg/kgDADS的剂量适合后续实验组（图2）。75只雌性小鼠随机分为五组：对照组、DSS、CA+DSS（6mg/kg）、CA+DSS+DADS（20mg/kg）和DSS+DADS（40mg/kg）。治疗十五天后，收集所有小鼠的粪便并储存在-80°C。通过眶后穿刺采血，然后通过颈脱位处死小鼠并收获它们的结肠和脾脏。
图2
不同浓度DADS对白念珠菌感染小鼠的影响生存研究
a)结肠长度
b)结肠长度相关统计分析
c)各组动物的疾病活动指数
DSS诱导的肠道白色念珠菌感染通过20mg/kgDADS在小鼠中得到缓解
根据实验结果，20mg/kg被认为是以下实验分组的最佳DADS浓度（图3A）。以DSS诱导结肠损伤的小鼠为模型对照组(DSS)，以DSS+DADS治疗的小鼠为实验组。虽然施用DSS和白色念珠菌显著降低了小鼠的体重和存活率，但DADS治疗减轻了这些影响（图3B、C）。此外，与CA+DSS组相比，DADS治疗导致粪便白色念珠菌的负荷显著降低（图3D，E）。这些数据表明，与6mg/kg相比，20mg/kgDADS治疗可以更好地缓解DSS诱导的小鼠肠道白色念珠菌感染。至于40mg/kgDADS，则没有改善。
图3
DADS减轻了白色念珠菌感染小鼠的症状
a)白色念珠菌灌胃感染和20mg/kgDADS给药示意图
b)体重变化
c)生存研究
d)粪便中的真菌负担
e)粪便中的真菌负担
DADS在感染白色念珠菌的小鼠中表现出抗炎作用
脾脏大小可以反映小鼠的炎症。DSS和白色念珠菌增加了脾脏/体重比，DADS显著改善了这一点（图4A、B）。此外，作者使用ELISA来量化促炎细胞因子的表达，即IL-6和IFN-γ。值得注意的是，DSS和白色念珠菌导致血清和结肠中IL-6和IFN-γ的显著增加，这些变化可以通过DADS治疗逆转（图4C、D）。为了研究DADS对肠道炎症的影响，比较各组之间的结肠长度和组织学变化。与上述结果一致，DADS改善了在用DSS和白色念珠菌治疗的小鼠中观察到的结肠缩短（图5A、B)。
图4
DADS在感染白色念珠菌的小鼠中表现出抗炎作用
a)脾脏大小和脾脏/体重比
b)脾脏/体重比
c)结肠中IL-6和IFN-γ的浓度
d)血清中IL-6和IFN-γ的浓度
DADS保护了白色念珠菌感染小鼠的上皮屏障。
组织学检查结果显示，白念珠菌感染小鼠的黏膜腺体部分丧失，黏膜下层和肌肉层侵蚀，中性粒细胞浸润增加，DADS可缓解这种情况（图5C、D）。还通过量化血清中的FITC含量来评估对肠道的损伤，这表明DADS可以改善DSS和CA+DADS组中增加的通透性（图5E）。此外，还定量分析了结肠中紧密连接蛋白Claudin-1和Occludin的表达水平；这些蛋白质在肠道白色念珠菌中显著减少感染小鼠并在CA+DSS+DADS组中得到改善（图5F，G）。这些数据表明，DADS治疗可以改善DSS和白色念珠菌对肠道屏障的损害。
图5
DADS保护了白色念珠菌感染小鼠的上皮屏障
a)结肠长度
b)结肠长度相关统计分析
c)结肠病理变化的HE染色
d)结肠病理变化相关评分
e)血清中的FITC水平
f)紧密连接蛋白的水平
g)紧密连接蛋白的水平统计
DADS改变了DSS诱导的肠道白色念珠菌感染小鼠的肠道微生物群落组成
PCA显示白色念珠菌、DSS和DADS治疗诱导了肠道微生物群组成的变化。此外，来自DSS和CA+DSS组的粪便样本以高度相似性聚集在一起，但在DADS处理的小鼠中，来自CA+DSS+DADS组的样本与对照样本聚集在一起（图6A）。PCA还区分了CA+DSS和CA+DSS+DADS组，这表明这些肠道微生物群落存在显著差异（图6B）。如图3C、D所示，作者确定了组间属水平前15种细菌的相对丰度。拟杆菌属、大肠杆菌-志贺氏菌属、Lachnospiraceae_NK4A_group、Parabacteroides等在所有组中都表现出较高的相对丰度。与白色念珠菌感染的小鼠相比，DADS治疗组的大肠杆菌-志贺氏菌和副杆菌属的相对丰度降低。
关键细菌通过热图可视化并通过Wilcoxon秩和检验进行分析（图7A、B）。在门水平上，与肠道白色念珠菌感染组相比，DADS治疗与Proteobacteria丰度降低（P=0.，图7C）和Tenericutes丰度增加（P=0.，图7D）相关（P0.05）（图7A）。如图7B所示，在属水平上，大肠杆菌-志贺氏菌（P=0.，图7E）、粪杆菌（P=0.，图7F）、副拟杆菌（P=0.，图7G）和链球菌（P=0.，图7H）显著下降，而普氏菌科_NK3B31_group（P=0.，图7I）、瘤胃梭菌（P=0.，图7J）、瘤胃球菌科_UCG-（P=0.，图7K)和颤杆菌(P=0.，图7L)在DADS处理的小鼠中富集。
图6
DADS改变了白色念珠菌感染小鼠的肠道微生物群落组成
a)主成分分析
b)CA+DSS和CA+DSS+DADS组主成分分析
c)组间属水平前15种细菌的相对丰度
图6
关键细菌体现
a)门水平的关键细菌热图
b)属水平的关键细菌热图
c)Proteobacteria相对丰度
d)Tenericutes相对丰度
e)Escherichia–Shigella相对丰度
f)Faecalibacterium相对丰度
g)Parabacteroides相对丰度
h)Streptococcus相对丰度
i)Prevotellaceae_NK3B31_group相对丰度
j)Ruminiclostridium相对丰度
k)Ruminococcaceae_UCG的相对丰度
l)Oscillibacter相对丰度
DADS改善了DSS诱导的肠道白色念珠菌感染小鼠的粪便代谢物谱
代谢变化与肠道微生物群的改变密切相关，也被认为是肠道炎症的重要标志。因此，作者进行了LC-MS非靶代谢分析以检测组间差异表达的代谢物和相关的关键代谢途径。在五组中的30个粪便样本中共鉴定出8,种代谢物。PCA散点图显示了聚集的QC样品，这表明代谢组学分析的质量很高（图8A）。
作者使用二维PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析进一步确定了CA+DSS和20mg/kgDADS治疗组之间代谢特征的差异（图8B-D）.接下来，为了识别关键代谢物，作者在热图上可视化了前50种代谢物，并确定了在白色念珠菌感染小鼠和DADS治疗小鼠之间显著差异表达的19种代谢途径（P0.05，图8E，F）。
此外，作者确定了17种重要的代谢物，以便在两组之间进行进一步分析。所有与色氨酸代谢相关的差异表达代谢物在DADS组中均上调，包括4-(2-氨基苯基)-2,4-二氧代丁酸、犬尿酸、N-乙酰靛红、5-羟基吲哚乙酸、喹啉-4,8-二醇,4-(2-amino-3-hydroxyphenyl)-2,4-dioxobutanoicacid,3-methyldioxyindole,和2-formaminobenzoylacetate。与感染白色念珠菌的小鼠相比，DADS治疗的小鼠中的一些代谢物，如PGB2、PGD2、TXA2和脂氧素A4的水平升高。此外，胆汁分泌途径的一些代谢物在DADS治疗的小鼠中处于较高水平，包括脱氧胆酸、石胆酸、鹅去氧胆酸和胆酸。
图7
DADS对白色念珠菌感染小鼠粪便代谢物的影响
a)所有组PCA
b)CA+DSS+DADS和CD+DSS组PCA
c)PLS-DA模型
d)OPLS-DA模型
e)两组之间差异改变的代谢物的热图
f)气泡图中显示的差异代谢途径
相关讨论
肠道白色念珠菌的定植和侵袭通常是播散性白色念珠菌感染的先决条件。迄今为止，虽然许多研究报道肠道微生物群、代谢物和肠道白色念珠菌可以相互作用，但缺乏全面的研究，因为肠道菌群和代谢物的具体变化以及调节机制在肠道白念珠菌感染因干预措施。本研究主要探讨了DADS（俗称大蒜素）对DSS诱导的肠源性白色念珠菌感染小鼠肠道菌群、代谢物和肠道屏障的影响。结果表明，DADS可通过增加肠道紧密连接蛋白的表达，减少肠道炎症（反映在存活率、体重变化、结肠长度变化、DAI评分和HE评分）并降低血清和结肠中炎症因子的表达。此外，DADS改善了肠道白色念珠菌感染小鼠的肠道微生物群和肠道代谢物谱，并增加了有益细菌的表达以及相关胆汁酸和氨基酸的表达。
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文章通过建立DSS诱导的肠道白色念珠菌小鼠模型，模拟人类肠道真菌感染。一方面证实了白色念珠菌可以增强DSS结肠炎的严重程度，另一方面通过微生物组学和代谢组学等手段确认了DADS治疗可以改善肠道生态失调（改变肠道微生物群和代谢物）、肠道通透性和全身炎症反应。深入了解DADS治疗的效果可能会为肠道白色念珠菌感染提供新的治疗策略。
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