白癜风治疗费用高吗 http://pf.39.net/bdfyy/bjzkbdfyy/150531/4632345.html摘要
目的
溃疡性结肠炎（UC）的发病机制与肠道菌群失调有关。我们推测，在病*群落中，肠道黏膜的改变在UC发病机理中起着重要作用。这项研究旨在表征黏膜病*及其在健康和UC中的功能。
设计
对来自中国三个不同地理区域（UC=91；健康对照组=76）的名受试者的直肠黏膜进行了深度宏基因组学的病*样颗粒制剂测序和细菌16SrRNA测序。评估UC黏膜中的病*和细菌体改变，并与患者元数据进行关联。我们应用medoids聚类算法将黏膜病*群落分为两类，分别称为黏膜病*亚群1和2。
结果
结果显示UC患者的黏膜病*，尤其是有尾噬菌体有增生，与健康对照组相比，黏膜有尾噬菌体的多样性，丰富性和均匀性则有所下降。黏膜病*组的改变与肠道炎症有关。UC的黏膜病*之间的个体差异高于对照组。大肠杆菌噬菌体和肠杆菌噬菌体在UC中的含量高于对照组。与亚群1相比，亚群2以UC患者为主，并且显示出各种病*种类的大量损失。UC患者表现出多种病*功能的明显丧失，而多种病*功能，特别是与宿主细菌适应性和致病性相关的噬菌体功能，在UC黏膜中明显富集。UC中黏膜病*和细菌之间的intensivetranskingdomcorrelations显著减少。
结论
本研究首次证实UC以绿脓杆菌黏膜实质性改变和功能性畸变为特征。溃疡性结肠炎黏膜中尾状病*噬菌体的富集、噬菌体/细菌*力功能的增强和病*-细菌相关性的丧失，表明黏膜病*组可能在UC发病机制中发挥重要作用。
引言
UC是IBD的一个亚型，是一种影响整个大肠的缓解性和复发性炎症性疾病，通常从直肠开始并向近端扩散。在21世纪，UC的发病率正在增加，特别是在新兴工业化国家。虽然IBD的病因仍不清楚，它被认为是由遗传易感个体对肠道微生物群的免疫反应加重引起的。
肠道微生物群对人类健康很重要并且与IBD有关。令人信服的证据表明，肠道微生物在疾病的发病机制中起着关键作用，而地理、饮食和民族因素影响微生物组成。在IBD中，大多数微生物群的研究都是在疾病发生过程中研究细菌菌群及其与宿主的关系。随着高通量测序技术的进步，肠道微生物群中不可培养的病*成分被认为是肠道微生物生态系统的重要栖息地，据信，病*生物实体的数量被认为远远超过细菌种群的数量。健康的人类粪便病*组由感染真核生物的病*和感染细菌细胞的噬菌体组成，以双链DNA尾病*为主，肠道噬菌体在个体之间表现出巨大的多样性，并且在时间上是稳定的。它们潜在地感染其细菌宿主，与肠道细菌共同进化，这有助于其噬菌体的遗传多样性和传染性的遗传漂变，并且在压力下，它们产生可以感染和杀死其他细菌的后代。
到目前为止，我们对病*在IBD发病机制中的作用知之甚少。其他人报告说，在患有IBD的小鼠和人类中，随着噬菌体（尤其是尾状病*）的增加，粪便病*组发生了变化。为了解决肠道病*是否在IBD中发挥重要作用的问题，了解黏膜病*在健康和疾病中的组成和功能至关重要。在这项研究中，我们假设病*在溃疡性结肠炎（UC）中的肠道黏膜衬里发生了显著改变，它们在黏膜炎症中起着重要作用。我们从健康人和UC患者的直肠中富集了病*样颗粒（VLP），并进行了超深病*基因组测序和16SrDNA测序，以确定UC患者和健康人的黏膜病*组、细菌体和病*-细菌的相关性。对这些更广泛的微生物组进行测序分析将阐明相关的微生物变化，从而允许保护性或致病性炎症有机体的表达。据我们所知，这项研究是迄今为止首次也是规模最大的一次对健康和UC黏膜病*组特征的研究。
结果
UC黏膜病*多样性的变化
我们比较了63例UC患者和48位健康受试者的黏膜病*。平均而言，从富集的直肠VLP制剂中获得了±个干净的配对末端读数。在UC和对照中按顺序，属和种水平研究黏膜病*组成。在目水平上，有尾病*是在UC黏膜中检测到的主要细菌病*（噬菌体），而在属和种水平上，在UC黏膜中检测到的优势病*分别是抗坏血酸病*和链球菌噬菌体。
在物种水平上，与健康受试者相比，UC受试者表现出黏膜病*组多样性和丰富度降低（t-test，p分别为0.和0.）。接下来，我们研究了最主要的黏膜病*，有尾病*噬菌体的变化，发现UC的有尾病*丰度显著高于对照组（Mann-Whitney检验，p=0.，图1A），而有尾病*目的物种多样性、均匀性和丰富度与对照组相比有所下降（t-test，分别为p=0.，0.,0.，见图1B）。总的来说，这些发现表明溃疡性结肠炎患者黏膜病*体的失调。
图1:UC中黏膜病*的数量和多样性发生变化。
与UC患者的非炎症黏膜相比，炎症黏膜显示出更多的总病*和有尾病*噬菌体的富集（Mann-Whitney试验，p=0.和0.）。与健康对照黏膜相比，溃疡性结肠炎患者的炎性黏膜总病*和有尾病*噬菌体的多样性、均匀性和丰富度也显著降低（Mann-Whitney检验，均p0.05span=""）。相比之下，UC患者的非炎症黏膜和健康对照黏膜之间的黏膜病*组多样性没有差异。总的来说，这些发现表明肠道黏膜炎症与溃疡性结肠炎恶化的黏膜病*体失调有关。
UC中不同的黏膜病*构型
使用非度量多维标度（NMDS）分析，我们评估了UC患者和健康对照之间在黏膜病*群落中的差异。我们发现，在物种水平上，UC受试者的黏膜病*与健康对照组的黏膜病*有显着差异（基于Bray-Curtis差异，adonistestp=0.，图2A）。尽管疾病解释了4.3％的病*组成变化，但健康和UC之间的病*结构差异在两个NMDS轴上都非常明显（t-test，p=0.和0.0，分别用于MDS1和MDS2的比较，图2B）。此外，UC患者的病*群落差异显着高于健康个体（t-test，p2.2e-16span=""，图2C）。这些数据表明，UC的病*体失调是高度个体化的。
图2健康和UC组间和组内病*群落结构差异。
接下来，我们进行了DESeq分析，以确定UC和对照之间在科、属和种水平上存在差异的分类群。UC中比对照黏膜中更多的类群被发现富集（图3）。在家族水平上，微绒毛病*科（单链DNA噬菌体）、肌病*科、荚膜病*科（尾状病*目的双链DNA噬菌体）和肺泡病*科（真核病*）在UC中比对照组更为丰富，而对照组的环病*（真核病*）高于UC（图3A）。在属水平上，PHIX微病*、p1病*、λ病*、t4病*、p22病*（全部尾状病*噬菌体）和正肺病*在UC中富集，而巨病*-球虫病*、微小病*和脊椎动物感染病*-正痘病*（均为真核病*）在对照组中富集（图3B）。与这些发现相一致，溃疡性结肠炎中尾状病*噬菌体种类的丰度较高，包括大肠杆菌噬菌体和肠杆菌噬菌体（图3C）。综上所述，这些发现表明原核病*尤其是尾病*噬菌体在溃疡性结肠炎黏膜中的不正常现象非常突出，而一些真核病*在健康人体内更为丰富，这表明细菌失调与溃疡性结肠炎的噬菌体扩张之间存在关联。
图3健康和UC黏膜在科，属和种水平上的差异病*分类群。
最近的研究表明，地理因素对肠道微生物组的组成具有影响。我们纳入了来自中国两个不同地区的56位华裔受试者（北京，n=40；浙江省象山，n=16），调查健康对照组和UC受试者的黏膜病*之间的差异。在来自香港队列的UC患者和健康受试者之间发现的不同的黏膜病*物种中，我们能够在其他队列中复制出两种病*物种：Chrysochromulinaericina病*和Mimivirus，表明了黏膜病*组变异的地理效应。UC中过度存在藻类感染埃里希纳病*，可能表明藻类相关饮食对IBD有害。同时，UC中大量存在的巨型病*拟态病*（一种潜在的肺炎致病菌）与观察到的IBD患者一致，可能会增加包括肺炎在内的感染机会。
健康和UC中的黏膜病*组群落
研究表明，细菌微生物群与IBD有关。由于观察到的黏膜病*亚群之间高度不同，我们研究了健康和UC中黏膜病*组的聚集。通过在物种丰富度分布图上使用围绕类固醇聚类算法的分区，我们发现病*群落汇聚成两个簇（以下称为黏膜病*组亚群，图4A）。在85个亚群1集群受试者中，有40名（47％）为UC患者。相比之下，在26个亚群2的集群受试者中，UC患者为23人（88％）（图4A），这表明UC的患者与亚群2的病*组构型存在显着相关性（χ2检验，p=0.）。然后，我们实施了DESeq和RamdomForest分析，以确定区分这两个亚群的病*种类。在亚群1和亚群2的病*组之间发现了46个物种，其中20个物种高度存在，而26个物种在亚群2种显着减少（图4B）。在亚群2中，大肠杆菌噬菌体，肠杆菌噬菌体和未培养的尾状病*噬菌体是数量最多、作用规模较大的特异性噬菌体。
图4健康和UC中的黏膜病*亚群。
为了探讨健康个体和不同UC亚群之间黏膜病*组组成的差异，我们量化了所有研究对象中病*核心种、常见种和独特种（分别对应于大于50%、20%–50%和20%span=""的个体之间共享的病*种）的存在率。健康个体与UC亚群1中个体的核心种、普通种或特有种的比例没有显著差异，核心种在UC亚群2中个体中所占的构成病*种类的比例显著高于对照组和UC亚群1中个体（均p0.0span=""，单向方差分析[ANOVA]，图5A，B）。然而，与对照组相比，UC亚群个体的常见和独特物种比例都有所降低（分别为p0.0span=""和p0.01span=""，单向方差分析，图5A，B）。然后，我们评估了这些病*物种的丰度，发现虽然几个顶级核心物种在UC亚群2个体中更为丰富，但与健康对照组和UC亚群1中个体相比，UC亚群2个体中的常见物种和独特物种减少或消失（图5c）。
图5不同UC亚群中核心、常见和独特病*种类的显著变化。
利用RandomForest，我们对北京和象山两个队列的受试者进行了黏膜病*体的分类。所有受试者被归为亚群1。在香港队列中，健康对照组与UC之间的对亚群1所有的个体差异分析确定了一组独特的病*种类。然而，只有两个物种被复制，即感染藻类的费尔德曼亚种病*，在象山队列中，UC亚群1受试者中的藻类感染明显高于对照亚群1中的受试者。在北京队列中，对照亚群1中的受试者假单胞菌病*含量明显高于UC亚群1的受试者。总而言之，这些数据强调了对黏膜病*结构的地理影响，这可能导致队列间黏膜病*成分的变化，并且可能与包括饮食和生活环境在内的外部因素有关。
UC黏膜病*组的功能改变
为了评估黏膜病*的功能，我们针对基因本体论（GO）和Pfam蛋白家族数据库对病*序列进行了HUMANN2分析。由于肠道黏膜病*组功能的本质尚未被充分研究，我们只能描述一小部分病*reads的功能。在带注释的功能中，膜的重要组成部分，DNA结合（GO术语），ATP结合盒（ABC）转运蛋白和整合酶核心结构域（Pfam蛋白）是突出的蛋白质/功能，表面病*在病*宿主生物学中起着积极作用，肠道病*和细菌之间有着重要的相互作用。
然后，我们比较了健康和UC之间预测的黏膜病*体功能。尽管健康人和UC之间最丰富的功能在丰度上没有差异，但健康个体在GO和Pfam蛋白功能方面表现出更丰富的病*体功能，而UC受试者表现出明显的功能缺失（图6）。尽管如此，一些分子功能被确定在UC中比在健康黏膜病*组中更丰富，包括DNA模板转录负调控、β-内酰胺酶、谷氨酰胺氨基转移酶、糖水解酶、II/IV型分泌系统和多铜氧化酶，这些都与噬菌体对宿主的裂解作用以及细菌来源有关。提示UC患者黏膜病*功能的丰富与细菌适应度、致病性和耐药性有关。
图6UC黏膜多种病*功能显著丧失，同时细菌致病性相关功能增加。
黏膜细菌组的改变和黏膜上病*组与细菌组间的跨域网络
我们进一步评估了UC黏膜与健康对照黏膜中细菌微生物组的变化。细菌多样性和丰富度显著增加（t检验，p分别为0.和0.），表明UC患者黏膜中多种细菌的扩张。UC黏膜细菌体在门、科和属水平上显示出与对照组不同的结构。定量差异分析确定了一些区分健康和UC黏膜的细菌类群。其中，硬壁菌（门）、假单胞菌科、瘤胃球菌科、热科、未分类梭状芽孢杆菌、细脉孢科（科）和副球菌（属）在UC中的富集程度明显高于对照。
为了描述黏膜细菌体和病*组之间的关系，我们评估了细菌和病*组α多样性（多样性、均匀性和丰富度）之间的相关性。在对照组中，界内α多样性指标之间存在显著相关性（图7A）。然而，在UC中，在对照组中发现的细菌界内α多样性的相关性丢失（图7A），这表明UC黏膜中细菌菌群的不良状态比病*群更为严重。然后我们评估了对照组和UC黏膜中细菌属和病*种类之间的相关性。UC病*-细菌相关性的改变可归因于病*-细菌联合的丧失和新病*-细菌联合的出现。与对照组相比，UC患者的细菌-病*相关性更大（图7B）。在这些细菌与病*的相关性中，大多数为负相关。然而，在UC黏膜样本中观察到显著的细菌-病*相关性的数量显著收缩，同时UC中的相关性与对照组相比有所减弱（图7B）。特别是，在对照组中，病*种类纤维素噬菌体、芽孢杆菌噬菌体、伯克霍尔德氏菌噬菌体、酸性硫杆菌噬菌体（全尾状病*噬菌体）、霍氏病*和黏膜细菌之间的相关性广泛加强，而在UC中则明显减弱。这与UC患者中纤维素噬菌体和酸性硫杆菌噬菌体的丰度增加相一致，同时这两种噬菌体和黏膜细菌之间的相关性也在减少。这些结果表明，UC中的病*-细菌-微生物群关系发生了变化，病*和细菌之间的相互联系变得更少，更加专业化，进一步暗示了黏膜病*和细菌之间的平衡对人类健康的重要性。
图7健康和UC中的黏膜细菌-病*相关性模式。
讨论
据我们所知，这项研究代表了第一次也是最深入的人类黏膜病*病研究，该研究使用了基于丰富病*组制备的专用宏基因组学方法。我们发现，UC患者表现出一种不正常的黏膜病*，其特征是病*丰度增加，尤其是尾病*噬菌体，病*多样性、丰富度和均匀度降低。鉴于病*组的性质尚未得到充分研究，病*数据库仍然很小且不完整，未知病*可能影响多样性的估计，从而限制了我们在健康和UC中分离黏膜病*体的努力。我们还观察到溃疡性结肠炎黏膜病*组的功能改变，这些改变与噬菌体溶解周期和细菌宿主特性，包括细菌适应、抗生素耐药性和致病性有关。炎症与病*组分的改变有关，感染藻类的病*在UC中比对照组更为丰富。我们假设，宿主炎症和环境因素（如药物或饮食）可能是黏膜病*体改变的重要因素，这些改变与细菌微生物群和宿主免疫反应相互交织。在小鼠中，已经证明结肠炎期间噬菌体数量的增加与病理宿主的肠道炎症有关，并且炎症可以促进小鼠体内的自由噬菌体产生和随后的转移。在人类中，在IBD和艰难梭菌感染的患者中，尾病*属的数量非常丰富。在另一项研究中，在健康人身上发现了一个健康的核心噬菌体组，UC患者粪便中这些核心噬菌体的数量减少了26。最近，比利时队列的UC患者粪便真核病*组丰度增加。这项研究中UC黏膜中大肠杆菌噬菌体和肠杆菌噬菌体的丰度增加以及核心病*物种数量的减少与大肠埃希氏菌小鼠和IBD患者粪便的发现一致。我们无法判断病*组的改变是黏膜炎症和上皮屏障脱落的原因还是后果。未来的动物研究将有必要对其进行进一步的研究。
我们观察到UC黏膜中的大肠杆菌噬菌体和大肠杆菌属细菌之间的边际负相关（图7B）。我们的研究显示，在UC黏膜中，大肠杆菌噬菌体的丰度和与大肠杆菌属细菌之间的拮抗关系增强，以及其他人在大肠杆菌噬菌体和大肠杆菌粪便中的扩张，可能表明，肠黏膜上的大肠杆菌噬菌体竞争与粪便中两者的共同扩张有关，表明肠道中有噬菌体诱导和复杂的噬菌体-细菌动力学。据推测，除了经验性的“捕食者-捕食者”噬菌体细菌动力学外，在肠道环境中还存在着“致胜者”和“*备竞赛”噬菌体细菌动力学，在这些环境中噬菌体会和细菌共同扩张和共同进化，尤其是当宿主处在压力之下时。
肠道黏膜中噬菌体组成的改变会影响细菌的微生物群生态。噬菌体是细菌适应性和多样性的主要驱动力。细菌的溶解可能导致核酸，蛋白质和脂质的释放，而这些核酸，蛋白质和脂质则是与病原体相关的分子模式，引发炎症反应，诱导细胞浸润，细胞因子产生，甚至组织损伤。在胃肠道中，噬菌体负责细菌群体中遗传元素的水平转移，包括那些导致抗生素抗性和疾病发病机制的遗传因素。
尽管在UC中大量存在各种噬菌体，但在健康个体中某些真核病*更为丰富。慢性病*感染在人类中很常见。急性和慢性病*的感染史有助于宿主免疫教育和成熟，特别是在生命早期发生的时候。病*病原体驱动的选择有助于塑造免疫系统，提高免疫耐受性和记忆力，从而预防自身免疫性疾病的发展。
由于宿主和环境赋予的条件和压力变化，人类病*迅速进化。据报道，有许多因素导致人群中细菌相对于菌群的高度变异。在香港人群与中国其他人群之间发现的鉴别性病*物种不一致，意味着黏膜病*构型的高度变异，可能是一个地区性的人群特异性对病*体结构的影响。然而，我们的研究受到中国队列样本量的限制，未来大规模人群研究对于确认健康和IBD中的普遍和人群特异性病*组具有重要意义。
据报道，粪便和黏膜样品的微生物群组成不同。IBD的研究主要集中在粪便样本上。关于IBD的失调程度一直存在争议，尤其是在黏膜层面。研究报告，UC黏膜细菌组多样性、丰富度和组成发生了变化，结果不一致。多项研究表明，IBD黏膜细菌多样性和丰富度下降，然而，其他一些研究表明，UC和对照组之间的细菌多样性和丰富度水平相似，而另一些研究则相反，IBD受试者的非炎症组织中的细菌丰富度比健康受试者组织高。尽管有一些研究报道了与健康黏膜相比，UC黏膜中的细菌存在过多，一些报道没有显着差异。另外，尽管有一些研究报道，与健康黏膜相比，UC黏膜中的菌毛减少了，其他组的UC黏膜丰满菌数高于健康黏膜，后者的结果与我们的数据相一致。观察到的异质性可能是多因素的，包括取样地点、药物使用、疾病表型、活动性与非活动性疾病、氧化应激水平以及人口、地理和饮食的差异，所有这些都被记录下来影响黏膜细菌的组成。需要进一步进行大规模的深入调查和验证。
总之，我们的发现强调了黏膜病*组在UC发病机制中的重要性。一个健康的黏膜病*组的特点是低丰度但多样化的病*群落，它与宿主和其他微生物群落处于动态平衡状态。溃疡性结肠炎（UC）黏膜病*组的改变可能与疾病的发病机制有关，而黏膜病*群落的恢复是治疗UC的有效方法。
方法队列描述和研究对象
本研究包括63例UC患者和48例香港健康患者的临床队列。此外，在知情同意的情况下，本研究也招募了20名健康受试者与来自北京的20例UC患者，以及8名健康受试者与来自浙江省象山的8例UC患者（全部为中国人）。患者入选标准包括年龄≥18岁且通过内窥镜检查，放射学检查和组织学检查确定为UC的受试者。包括在监测结肠镜检查或结肠镜检查期间同意采集结肠样本作为疾病活动评估一部分的连续性UC患者。从直肠获得组织活检。大多数患者处于临床缓解期。对照组包括接受结肠镜检查以筛查息肉，结肠直肠癌或因痔疮引起的直肠出血症状的个人，医院患者的朋友和配偶或伴侣，或任何有兴趣参与本研究的个人。连续健康的人接受了结肠镜检查，发现结肠镜检查正常，结肠镜检查后没有显微镜下的炎症迹象。
通过内窥镜检查收集来自研究对象的直肠活检样品，然后将其保存在-80°C进行下游黏膜病*和细菌分析。
VLP富集和VLP测序
根据先前描述的方法，使用改良方案，从UC患者和健康受试者的直肠活检中富集VLP。详细程序包含在在线补充附录中。
对VLPDNA进行定量（纳米滴），并通过超声（Covaris）随机破碎1μgDNA，然后构建文库。在cBot上对合格的文库进行扩增，以在流动单元上生成簇（TruSeqPEclusterKitV3cBotHS，Illumina）。扩增后的流动细胞在HiSeqXten系统（TruSeqSBSKIT-HSV3，Illumina）（华大国际，中国深圳；标准2×bp）上对扩增的流动细胞进行双端测序，每个样本产生-万个原始序列（5-8G原始数据）。详细的序列统计包含在在线补充表2中。序列处理和质量控制，从头组装和分类注释包含在在线补充附录中。
病*组数据分析
为了估计重叠群的丰度并计算序列多样性，使用Bowtie2（V.2.2.9）将所有读数与所得的重叠群进行比对。使用映射的序列数，重叠群长度和总序列数对序列数进行归一化，并代表每个重叠群的每千样本每千碱基的读数。这些值用于生成各种分类法级别的病*丰度表。将病*丰度数据导入RV.3.2.3。使用phyloseq计算R中的多样性，均匀度和丰富度。Spearman的相关性，并使用cor和cor计算其显着性。在R中分别测试功能。对于α多样性和分类单元丰富度中的病*与细菌的相关性，计算了Spearman的相关性。相关曲线是使用corrplotR包生成的。热图是使用pheatmapR软件包生成的。在线补充附录中包括DESeq，RandomForest和LEfSe线性判别分析。
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